第９章 プロセシング（加工）の今後の展望

4. レーザーマニュピレーション

著者：伊都 将司

目次

1. はじめに

 レーザーマニピュレーションとは、「光の力」で微小物体を操作する技術である。光子には運動量があり、光子の進行方向が変化する際にはその運動量も変化する。その際反作用として、光子の運動量を変化させた物質に対して力を及ぼす。この光の力、光圧を用いることで微小物体を任意に操作することが可能になる。光で微小物体を捕まえ、別のレーザー光を照射することでナノ・マイクロ材料の加工、粉砕、パターニング、生細胞のレーザー手術等が実現できる。本節では、レーザーマニピュレーションの歴史、原理とレーザーマニピュレーションを利用したナノ・マイクロプロセシング（加工）について解説する。
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2. レーザーマニピュレーションの歴史

 レーザーの発明から10年後の1970年、それまで応用面では注目されることのなかった光圧を用いて微粒子を捕捉する実験がベル研究所のAshkinによって行われた1)。この最初の光捕捉実験では、二本のレーザー光を対向させ、水中のポリスチレン微粒子に挟み込むように照射し、微粒子に働く力を釣り合わせることで光捕捉を実現した。その翌年、Ashkinは微粒子にレーザー光を下方から照射し、微粒子に働く光圧と重力を釣り合わせることで、一本のビームで微粒子を捕捉することにも成功した2)。この方法では、微粒子に働く重力と光圧を釣り合わせて光捕捉するため、微粒子に働く光圧の大きさを精密に測定することができる。
 1986年、Ashkinはレーザー光を顕微鏡対物レンズを用いて集光、照射すると、光照射された微粒子に働く光圧は常に集光位置に向くことを理論的に予想し、また実際に集光レーザー光による微粒子の捕捉に成功した3)。この光による捕捉技術を用いて微小物体を操作する技術がレーザーマニピュレーションである。この技術は「レーザートラッピング（Laser Trapping）」、「光ピンセット（Optical Tweezers）」等とも呼ばれ、様々な分野で利用されている。
 集光レーザー光による光捕捉技術は、一本のレーザー光で被捕捉粒子の三次元的な位置制御が可能であり、また光学顕微鏡を改造し、レーザー光を導入することで光捕捉が実現でき、顕微鏡下で微小物体を観察しながら操作することができる等の利点がある。実際、Ashkinらは植物細胞や単細胞生物の細胞内小器官を顕微鏡で観察しながら光捕捉し、ステージを移動させることで、細胞内で小器官の位置をリアルタイムで観察しつつ移動させることに成功している4)。
 これまでに、光圧を用いて様々な研究がなされている。例えば、光圧をマイクロマシンの動力源として用い、微小構造物の形状を工夫して効率よく回転力を与える研究5,6)が浮田らによって、また、河田らによるエバネッセント光による微粒子駆動の、三澤らによる円偏光レーザー光の持つ角運動量を利用した液晶液滴の回転と、光スイッチングへの応用8)等様々な研究報告がある。
 生物学の分野においても、細胞や細胞内小器官の大きさが光捕捉可能なサイズ領域にあり、捕捉用レーザー光の波長を適当に選択すれば非接触、非破壊で生体物質を操作できることもあって、細胞一つずつの分離、培養9)、バクテリアの鞭毛や精子の運動力学研究10)、赤血球の形状復元11)、細胞接着12)等盛んに利用されている。
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3. 光トラッピングの原理

3.1 微粒子サイズが光の波長より大きい場合

 微粒子サイズがトラッピング光の波長より大きい場合、微粒子に働く光圧の大きさを求めるには複雑なMie散乱理論を用いる必要があるが、光トラッピングの原理を理解するには、幾何光学を用いた定性的なアプローチのほうが直感的で理解しやすい。対物レンズで集光したレーザー光を、溶媒に分散している透明な微粒子に照射したとき微粒子に働く光圧を図1を用いて説明する。微粒子と分散媒の屈折率が異なる場合、図1のAで代表されるように微粒子に入射したレーザー光は微粒子表面で屈折され進行方向が変わり、光子の運動量が変化する。この光子の運動量変化によって光圧が発生する。光線は微粒子から分散媒に出るときにも屈折されるためこのときにも光圧が発生する。すべての光線の寄与を加え合わせ光圧の合力を計算すると、微粒子の屈折率が分散媒の屈折率よりも大きい場合にはレーザー光の集光位置を向く力になる。

 今、微粒子が透明であり、媒質と微粒子の屈折率比が小さいとして微粒子表面における光線の反射を無視している。厳密には入射光は微粒子表面でわずかながら反射されるため、微粒子を光の進行方向に押す弱い力も働く。従って、光圧の合力は集光位置よりもわずかに光の進行方向に向くが、捕捉用レーザー光の波長に対して透明な物体の場合はこの項は無視しても問題はない。その他にも微粒子には重力、浮力なども働くが、これらの力も光圧による捕捉力に比べれば弱いことが実験的に確かめられている。実際にポリスチレンやポリメタクリル酸メチル（PMMA）等の微粒子が安定に光捕捉できることが確かめられている。
 金属微粒子のような反射率の非常に高い物質に対しては、光は表皮深さ程度までしか微粒子内部に進入できない。従って微粒子サイズが光の波長よりも大きい場合、光は微粒子を透過できず粒子表面で反射されてしまう。その際微粒子にはたらく光圧は、微粒子を光の進行方向に押す向きにはたらき、微粒子は捕捉されない。
 種々の理論的考察も行われており、微粒子形状が球形の場合13〜15)や、立方体の場合16)についての理論的アプローチや、金属酸化物のような、捕捉用レーザー光の波長に吸収をもつ微粒子の光捕捉についての検証17)の等が行われているので、これらの文献も参照されたい。
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3.2 微粒子サイズが光の波長より小さい場合(ナノメートルサイズの粒子)

 被捕捉物体のサイズがトラッピング光の波長より十分小さい場合、被捕捉物体に働く力は双極子近似を用いて定式化される。ここでは、数式を用いずにその概念を説明する。光を粒子に照射すると、粒子内の電子が光電場によって引っ張られ、粒子内に分極が生じる。光の周波数は非常に高く、その速さに追随できるのは質量の軽い電子のみであり、重い原子核は光電場ではほとんど動かない。光電場によって粒子内に電荷の偏りが生じた状態を模式的に表したのが図2である。二つの電荷qと-qが近接して存在するとき、これを電気双極子と呼ぶが、波長よりも充分小さな粒子に光を照射したとき、粒子は電気双極子と考えることができる。光電場は、実際はその周波数で電場ベクトルの方向を反転させているが、ここでは話を簡単にするため静電場中におかれた粒子を考える。二つのコンデンサーにそれぞれ異なる電荷がたまつた状態を考えて、それらを薄い絶縁体を間に挟んで、電気的接触がない状態で近接させた場合を考える（図3）。実際は、極板間の電場の向きは一様ではないが、電場強度には勾配が生ずるであろう。このとき、極板間に粒子をおいたとすると、粒子に誘起される分極は図のような双極子と考えられ、図から、双極子つまり粒子が電場強度の大きな方向に引つ張られるのが理解できる。一般的に、電気双極子をその強度に勾配のある電場中においたとき、双極子には電場勾配の方向に力が働き、この力を勾配力と呼んでいる。静電場中での勾配力の導出は、電磁気学の教科書等を参考にされたい18)。光電場の場合も同様で、光強度をI、電場をEとすると、I ∝ E2の関係があるから、強度分布を持った光を粒子に照射すると、粒子には光強度の高い方向へ勾配力が働く。レーザートラッピングでは、対物レンズでレーザー光を絞り込むことで光強度の空間勾配を大きくしている。図4は溶液中の粒子に、対物レンズで絞り込んだレーザー光を照射した様子を表している。ランダムにブラウン運動していた粒子にレーザー光が照射されると、粒子には光強度の高い方向に向かって勾配力が働くため、粒子は集光位置に引き寄せられる。粒子に働く勾配力の大きさは、レーザー光の強度、粒子の大きさ、粒子の誘電率の増加とともに大きくなる。



 粒子に働く力は勾配力だけではなく、散乱や吸収に起因した力も働き、それらは光の進行方向に働く斥力となる。従って粒子を安定に捕捉するには、勾配力が、散乱や吸収により発生する力に比べて十分大きくなければならない。NAの大きな対物レンズでレーザー光を回折限界程度まで集光するとこの条件が満たされ、粒子は安定に捕捉される。
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4. レーザートラッピングが適用可能な粒子サイズ

 レーザートラッピングでは、光照射された粒子には常に集光位置に向かって力が働き、安定に捕捉されるので、粒子は光圧ポテンシャルの中にいると考えることができる。溶液中の粒子は、絶え間なく不規則に熱運動（ブラウン運動）していることはよく知られている。溶液中で粒子を捕まえるには、光圧ポテンシャルの深さが、ブラウン運動による粒子の平均運動エネルギーよりも大きくなければならない。前述のように、粒子に働く力学的ポテンシャル、即ち光圧ポテンシャル深さは、粒子の材質が同じでもその粒径によって変化する。光圧ポテンシャル深さが平均運動エネルギーと釣り合うときを捕捉限界の目安だと考える。例えば、高分子材料としてよく知られているポリスチレンの球形粒子、及び金の球形粒子を水中でレーザートラップするとき、レーザー光の波長を1064nm、光パワー400mW、対物レンズの開口数1.30の条件で、水及びポリスチレン、金の誘電率を代入して理論的に計算すると、光圧ポテンシャル深さと熱運動の平均エネルギーが釣り合う粒径は、ポリスチレンの場合で10ナノメートル程度、金ナノ粒子の場合では数nm程度であると見積もられる。したがって、そのサイズが数nm〜10nm程度かそれ以上の大きさの粒子は溶液中でレーザートラッピング可能であると考えられる。
 光捕捉の捕捉力は、粒子のサイズや屈折率、分散媒の屈折率、レーザー光強度等により変化するが、上記の見積もりによると10nm程度より大きい粒子を捕捉することができる。これらは実験的に確かめられており、例えば、粒径28nm程度の金ナノ粒子19)や、粒径40nmのポリスチレンナノ粒子20)の光トラッピング等が報告されている。また、より小さな高分子鎖を用いた実験も行われている。平均慣性半径が十数nmの高分子鎖を集光位置に集め、微粒子を生成したという報告がなされており21,22)、これらの結果から、前述の光捕捉可能最小粒径の見積もりとほぼー致するサイズの粒子が捕捉できることが示されている。
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5. レーザーマニピュレーション装置

 光トラッピング用の光源としては、捕捉したい試料に対して吸収のない波長を選択する必要がある。そうすることで光吸収に伴う試料へのダメージを少なくできる。有機物や生体組織は近赤外光の吸収がほとんどないものが多く、そのため光トラッピング用の光源としては、Nd:YAGレーザーやNd:YVO4レーザー等の近赤外CWレーザーが用いられる場合が多い。
 光トラッピングではレーザー光を回折限界程度まで集光するため、CWレーザーを用いても二光子吸収が起こる場合があるので注意が必要である。可視域のレーザー光を用いてトラッピングする場合、一光子では試料に吸収がなくても、二光子吸収が起きると紫外光を吸収した場合と同じ効果がある。一般に有機物は紫外光を吸収し短波長になるにつれニ光子吸収断面積も増加すると考えられるため、トラッピング光のパワーを上げると容易に二光子吸収がおこり試料を損傷する場合がある。これに対し、波長1064mnのNd:YAGレーザーを用いた場合では、二光子吸収が起こった場合でも可視域の光を吸収する場合と同じであり、可視光に対して透明な試料に対してダメージを与えない。
 光トラッピングではレーザー光の集光位置に微粒子が捕捉される。捕捉用レーザー光の集光スポットを移動させれば、光捕捉した微粒子も集光スポットと共に微小空間内を移動する。増原、笹木らは、1990年代初頭光学系にコンピューター制御の電動ミラーを組み込み、捕捉用レーザー光集光スポットの焦平面上での任意走査を可能にし、光捕捉した微粒子を微小空間内で任意に移動可能なシステムを開発している23〜25)（図5）。また彼らは、単一光子計数システム、分光器、共焦点顕微鏡等の測定系とレーザーマニピュレーション装置を組み合わせることで、微小領域で粒子を捕まえ、分析できる様々な技術を提案した。

 レーザーマニピュレーションにより微粒子を捕まえ、それらを加工するには、もう一本別のレーザー光を顕微鏡下に導入する必要がある。そのシステムの一例を図6に示す。加工用レーザーは、用途に応じてその波長、パルスか連続発振か、パルスレーザーの場合はそのパルス幅や繰り返し周波数を検討してレーザーを選択する。対物レンズで集光して照射するため、1パルスあたりの工ネルギーはそれほど高くなくともよい。例えば、ビーム径が2mmのレーザーパルスを対物レンズで500nmのスポットに絞り込んだ場合、そのパワー密度は6×107倍になる。光学系での表面反射等で多少のロスはあるが、目的のプロセシング（加工）に必要なパワーの数倍程度の光エネルギーを供給できれば十分であり、逆にあまりハイパワーのレーザーを用いると光学系を損傷してしまうので注意が必要である。


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6. 複数の微粒子の同時操作

 これまでは、捕捉ポイントが一箇所の光トラッピングについて述べたが、複数個の微小物体を同時に操作するための提案もなされている。
 最も簡単なアプローチとして、複数のレーザー光を用いる方法がある。このとき、レーザービーム間で干渉が起こらないように注意しなければならない。レーザービーム間で干渉を起こすと、それぞれのビームの集光具合が他方のビームに影響され、全く独立したトラッピング点にはならず、設計通りの性能が得られない。例えば、一本の円偏光レーザー光を偏光ビームスプリッターで2本のビームに分ければ、互いに直交する偏光面をもった2本の直線偏光レーザー光をつくることができる。これらを集光することで、干渉の生じない2つの捕捉ポイントを形成できる23)。最近では、面発光レーザーアレイの2次元光強度分布を対物レンズで投影し、トラッピングポイントを多数個焦平面に形成する方法も報告されている26)。
 図5に示したコンピューター制御の電動ミラーを用いて、レーザー光の集光位置を任意のパターンに沿って繰り返し走査し、集光位置の軌跡上に微粒子を配列させる方法も提案されている24)。このとき、レーザー光の走査速度が低ければ捕捉された微粒子は集光スポットと共に運動するが、徐々に走査速度を上げていくと、光圧は媒質の粘性抵抗に負け微粒子は集光スポットの動きに追従できなくなり、十分高速に走査した場合、微粒子は集光スポットの軌跡に沿って捕捉される。つまり、微粒子のブラウン運動の時間オーダーに比べて十分高速にビームを走査した場合、走査パターン型に複数個の集光スポットを並べたのと同じ効果がある。その際、微粒子一つあたりに一秒間に照射されるレーザーパワーは減少するため、同じサイズの微粒子一つを捕捉する場合に比べて大きなレーザーパワーを供給しなければならない。
 最近では、液晶位相変調素子を用いて対物レンズ下に任意の3次元光強度分布を実現し、一本のレーザー光による複数個の微粒子の同時捕捉、移動も実現されている27)。
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7. レーザーマニピュレーションを用いたナノ・マイクロプロセシング（加工）

 レーザーマニピュレーションによるナノ・マイクロプロセシング（加工）の例を紹介する。先述のように、レーザーマ二ピュレーションを用いればナノ・マイクロ材料を一粒ずつ任意の位置に移動させ、加工することができる。
 三澤、増原らは、直交する偏光面を持った2本のレーザービームを用い、それぞれのビームで独立に捕まえた高分子微粒子を光重合を用いて接着しマイクロ構造体を作製した23,28)。また、マイクロ光造形により作製した微小なプラスチックモデルに、レーザーマニピュレーションで微小物体を接着することも可能である（図7）。著者らが行った図7の例では、マイクロ光造形で作製したアクリル系樹脂のマイクロ構造体の表面にポリスチレン粒子を移動させ、ナノ秒紫外レーザーパルスを照射し微粒子を過渡的に融解させて接着している。

 光重合反応や光熱反応を用いることで、ナノ粒子のパターニングも可能である。ただ、光学顕微鏡の空間分解能の限界はサブマイクロメートルであり、粒子サイズが数百ナノメートル以下になるとその存在を確認するのが困難になるため、ナノ粒子を確認するための工夫が必要になる。例えば、色素でナノ粒子を蛍光標識し、粒子からの発光をモニターする方法や、金属ナノ粒子等のように光散乱効率の高い粒子では、マニピュレーション用とは異なるレーザー光や照明光を粒子に照射し粒子からの散乱光をモニターする方法などがある。
 著者らが行った、単一ナノ粒子パターニングについて説明する。
 高分子ナノ粒子のパターニングには光重合反応を利用した29)。親水性モノマーのアクリルアミド、架橋剤N、N’メチレンビスアクリルアミド、光重合開始剤のエチレングリコール溶液に高分子ナノ粒子（粒径約220nm）分散させた。高分子ナノ粒子に含まれる蛍光色素からの発光を蛍光顕微鏡でモニターし、ナノ粒子を一粒ずつ確認しつつレーザーマニピュレーションで基板表面の所望の位置に移動させ、紫外レーザーパルスを捕捉用レーザ一光と同じ位置に集光照射すると、基板表面の高分子ナノ粒子の周りで局所的な光重合反応が誘起され、基板上にナノ粒子を包み込むようにポリアクリルアミドゲルが生成されてナノ粒子は固定化される（図8）。ナノ粒子を一粒ずつ固定化できていることを確認するため、ナノ粒子を光接着した後基板を洗浄乾燥させ、固定化したナノ粒子をAFMで詳細に観察した。そのAFM像を図8に示す。各AFM像中に紫外レーザーパルス照射時間を記しているが、紫外パルス照射時間の増加と共にゲルが成長していることが確認できる。また紫外レーザー光照射時間が短い場合の凹凸像の断面から、確かに高分子ナノ粒子を一つずつ接着できていることが確認できた。

 このとき、試料溶液に分散させる粒子の濃度（数密度）を適度に調整しておく必要がある。粒子密度が高すぎると、一度に多数のナノ粒子がトラップされてしまいその数を確認するのは困難であり、数密度が低すぎる場合は目的のナノ粒子を探すのに時間がかかってしまう。この場合の高分子ナノ粒子濃度は〜5.0×10-4Vol%であった。
多数のナノ粒子を同時に配列、固定化することもできる30)。先述のビーム走査型のレーザーマニピュレーションを用い、捕捉用レーザー光の集光スポットを一定のパターンを描くように繰り返し高速走査し、ナノ粒子を基板上に並べ、固定化用レーザー光も同様に走査しその配列を固定化する。捕捉用レーザー光（〜180mW）の集光位置を直線を描くように30Hzで300秒間繰り返し走査し、ナノ粒子をそのパターン上に配列させ、紫外レーザー光も同様のパターン上を走査しながら35秒間照射することで配列させたナノ粒子を固定化した。ガラス基板上に「H」状に配列、固定化したポリマーナノ粒子の光学顕微鏡像と蛍光顕微鏡像を図9に示す。「H」の文字は直線上に配列、固定化したポリスチレンナノ粒子群3本で構成されている。

 近年、金ナノ粒子はプラズモンセンサー等への応用が盛んであり、液中レーザーアブレーションによりそのサイズを制御する提案もなされている。レーザーパルスを金ナノ粒子分散液に照射すると、パルスエネルギーがある闕値を超えたると金ナノ粒子は過渡的に融解し、さらに照射するパルスエネルギーを上昇させると、レーザーアブレーションが起こり金ナノ粒子はより細かな粒子に粉砕される事が分かっている。レーザーマニピュレーシヨンで金ナノ粒子を一粒ずつ扱い、トラップ用レーザー光とは別のレーザーパルスを捕捉した金ナノ粒子に照射することで、単一金ナノ粒子の光溶接、光加工が可能となる。
 著者らが行った図10の例では、粒径80nmの金ナノ粒子を溶液中で光捕捉しガラス基板表面に移動させ、紫外レーザーパルスにより瞬間的に金ナノ粒子を融解させ基板に固定化した31)。このとき、固定化用レーザーパルス強度がナノ粒子を融解させる程度のエネルギー範囲内であれば、図10aに示すように金ナノ粒子一個がその形状を崩すことなく接着され、より高いエネルギーを与えると、図10bに示すように、ナノ粒子にフラグメンテーションが起こり、およそ10 – 40nm程度の微細な金ナノ粒子に分解され、基板上に堆積した。図10cはガラス基板の上に「I」字状にパターニングした金ナノ粒子のAFM像である。再現性よく金ナノ粒子を固定化できていることが分かる。このとき、実際の実験条件下では粒子を固定する際の精度が数十nm程度である。


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【参考製品】