共焦点レーザー顕微鏡はレーザービームとピンホールを用いて解像度の高いイメージングを行う顕微鏡のことである。

図1に一般的な共焦点レーザー顕微鏡の基本構成を示す。なお、図1は共焦点レーザー顕微鏡で多く用いられているエピ検出型である。

光源から照射されるレーザー光を、レンズで集光させピンホールに照射させる。光源の後に最初のピンホールは、レーザー光に若干存在する空間的に汚い成分を取り除くためにある。これによって、試料上の1つの点だけに光を集光することができる。

ピンホールを通過したレーザー光は、レンズでコリメート（コリメート：ビームをまっすぐ伝搬させる）され、ダイクロイックミラー (DM) またはビームスプリッタ（BS）を透過し、2次元走査を行うスキャナを介して対物レンズに入射される。対物レンズに入射された光は小さく絞られ、試料内で集光する。集光点で生じた光は対物レンズを通過し、DM（またはBS）で反射されてレンズに集光される。集光された光はピンホールを通過し光学フィルターを介して光検出器（ディテクター）で検出される。光学フィルターは試料にから発生した『レーザー光の波長以外の光』を観測したいときに挿入する。

集光面とピンホールの位置関係

共焦点レーザー顕微鏡の要は検出器前にあるピンホールである。図2 に示すように、試料から発生する光はFocal Planeにある集光点以外からでもOut-of-focus lightとして発生することがある。このOut-of-focus lightは顕微像をぼかしてしまい、ピントのあった鮮明な像が得られない。そこで、光の結像位置にピンホールを挿入し、Focus lightのみを通過させることによって、ピントのあった顕微像を取得できる。