二光子励起蛍光顕微鏡は、近赤外の超短パルスレーザー光を使い、生体内部(数百μmの深部まで)の蛍光強度(蛍光分子の濃度)分布を三次元的に画像化する装置である。

 

原理と特徴

非線形光学効果を利用した顕微鏡では、第二高調波顕微鏡、コヒーレント反ストークス・ラマン散乱(CARS)顕微鏡があるが、二光子励起蛍光顕微鏡は、観測できる対象が多いことと、超短パルスレーザーの登場により、最も普及した。

二光子励起蛍光顕微鏡では、超短パルスレーザーのパルス光を対物レンズを通して試料中の一点に集光する。その集光点からの蛍光強度を測定する。集光点の場所を変えてそれぞれの場所の蛍光強度が計測すると、蛍光強度(蛍光分子の濃度)分布が得られる。

一般的な二光子励起蛍光顕微鏡の光学系を図1に示す。レーザー光は、ビーム走査の光学系を通り、対物レンズで試料中に集光される。試料の蛍光は同じ経路を戻り、途中のダイクロックミラーで光検出器に導かれる。二光子励起蛍光顕微鏡は、三次元の空間分解能が得られる。共焦点顕微鏡と同じようにピンホールを設置することで、奥行き方向と深さ方向の空間分解能を2倍程度向上できるが、試料深部の蛍光を十分な強度で計測できないおそれがある。

通常の共焦点顕微鏡(一光子吸収)では観察深さの限界は数十μmといわれているが、二光子励起では数百μmの深部の観察が可能である。二光子励起蛍光顕微鏡は、生体組織の観察に優れており、多くの成果が報告されている[1]。特に生体組織深部の観察で利用されており、腎臓組織[2]、皮膚組織[3]、リンパ組織[4]、心筋組織[5,6]の観測例が報告されている。

schematic-diagram-TPEF

図 二光子励起蛍光顕微鏡の光学系(こちらの記事の図を使用)

二光子励起とは

光の強度が大きい場合に非線形光学現象が顕著になる。光の強度が大きいと、光子密度が高くなる。この時に、複数の光子が同時に分子に作用することになり、同時に吸収される確率が高くなる。この吸収を多光子吸収と呼ぶ。二つの光子が一つの蛍光分子に同時に吸収される現象が二光子吸収である。そして、二光子励起とは、この吸収により分子を励起することである。

一光子吸収では、一つの光子で分子を励起させるエネルギーが必要であるが、二光子吸収では、二つの光子が同時に作用するため、光子一つのエネルギーは半分である。光子エネルギーは波数に比例するため、一光子吸収の場合の波数に対して、二光子吸収では、波数が2倍となる。波数と波長は逆数の関係にある。二光子励起による蛍光強度は、光強度の2乗に比例する。

一般的な蛍光分子の二光子吸収断面積は小さいため、パルス光のピーク強度が大きい超短パルス光を用いて、二光子励起を行う。モード同期Ti:サファイアレーザーでは、5桁ほど効率が良くなる。また、一光子吸収では、レーザーの伝搬経路全てが蛍光発光するが、二光子吸収では、集光点付近で吸収が強くなるため、蛍光発光は点で観測される。

二光子励起による蛍光励起の特徴は、

  • 三次元的に走査することで、三次元空間分解能が得られる。
  • 観測部位以外の蛍光分子を励起しないため、蛍光試料の褪色を軽減できる。
  • 試料中で光散乱を抑える事ができるため、深い部位でも観察できる。
  • 近赤外光(一光子)で紫外光照射(二光子)の効果を得られる。

である。

 

参考文献

  • [1] F. Helmchen, et al.: Nat. Methods, 2, pp. 932-105, 2005.
  • [2] B. A. Molitoris, et al.: Am. J. Physiol. Renal Physiol., 288, pp. F 1084-F 1089, 2005.
  • [3] L. H. Laiho, et al.: J. Biomed. Opt., 10, 024016, 2005.
  • [4] P. Bousso, et al.: Immunity, 21, pp. 349-355, 2004.
  • [5] M. Rubart: Circ. Res., 95, pp. 1154-1166, 2004.
  • [6] T. Kaneko, et al.: Acta Histochem. Cytochem., 34, pp. 399-403, 2001.
  • バイオメディカルフォトニクス-生体医用光学の基礎と応用-, 電気学会 次世代バイオメディカル・レーザー応用技術調査専門委員会編, オーム社, 2009.